实时荧光定量ＰＣＲ仪百科知识
１． 定义与概述
实时荧光定量ＰＣＲ仪（Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ， ｑＰＣＲ）是一种基于聚合酶链式反应（ＰＣＲ）技术，通过荧光信号实时监测ＤＮＡ扩增过程的高精度分子生物学仪器。
核心功能：
定量检测ＤＮＡ／ＲＮＡ的初始模板量（**定量或相对定量）。
检测基因表达水平、病原体载量、基因突变等。
广泛应用于疾病诊断、基因研究、食品**检测等领域。
２． 核心技术原理
荧光标记机制：
ＴａｑＭａｎ探针法：探针带有荧光基团和淬灭基团，扩增时探针水解释放荧光。
ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ法：染料嵌入双链ＤＮＡ发出荧光，成本低但特异性稍差。
分子信标（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎ）：茎环结构探针，靶序列结合后发光。
检测模式：
终点法：仅检测**终产物量。
实时法：通过Ｃｔ值（阈值循环数）动态分析扩增曲线，实现精准定量。
３． 核心参数与性能指标
| 参数 | 意义 | 典型范围／要求 |
|---|---|---|
| 检测通道数 | 支持多色荧光检测能力（如ＦＡＭ， ＨＥＸ， ＲＯＸ） | １－６通道（多用于多重ＰＣＲ） |
| 灵敏度 | **低可检测ＤＮＡ拷贝数 | 单拷贝（＜１０ ｃｏｐｉｅｓ／μＬ） |
| 温控精度 | 温度均一性和升降温速率 | ±０．１°Ｃ，升降温≥４°Ｃ／秒 |
| 动态范围 | 线性定量范围（Ｌｏｇ值） | ７－８个数量级（１０＾１～１０＾８拷贝） |
４． 主要应用场景
**诊断：
病毒／**核酸检测（如新冠病毒、ＨＰＶ、结核分枝杆菌）。
肿瘤基因突变检测（ＥＧＦＲ、ＫＲＡＳ等）。
科研领域：
基因表达分析（ｍＲＮＡ定量）。
ｍｉＲＮＡ检测、ＳＮＰ分型。
农业与食品：
转基因成分鉴定。
食源性致病菌（如沙门氏菌）快速检测。
５． 与传统ＰＣＲ的对比
| 特性 | 实时荧光定量ＰＣＲ | 传统ＰＣＲ |
|---|---|---|
| 定量能力 | 实时监测，精准定量（基于Ｃｔ值） | 仅终点定性／半定量（电泳分析） |
| 检测速度 | １－２小时（含数据分析） | ２小时＋额外电泳时间 |
| 污染风险 | 闭管操作，污染风险低 | 开盖电泳，易污染 |
| 成本 | 较高（荧光试剂／探针） | 低 |
６． 操作流程与注意事项
标准流程：
样本制备：提取ＤＮＡ／ＲＮＡ并反转录为ｃＤＮＡ（ＲＮＡ检测时）。
反应体系配制：加入引物、探针、模板、Ｔａｑ酶等。
程序设置：设定扩增程序（预变性→循环扩增→熔解曲线分析）。
数据分析：通过软件计算Ｃｔ值，生成标准曲线或相对表达量。
关键注意事项：
避免ＲＮＡ降解（使用ＲＮａｓｅ抑制剂）。
防止交叉污染（分区操作、ＵＮＧ酶防残留）。
验证引物特异性（熔解曲线单峰）。
７． 主流品牌与型号
| 品牌 | 代表型号 | 特点 |
|---|---|---|
| Ｂｉｏ－Ｒａｄ | ＣＦＸ９６ | 高性价比，５通道检测，适合中小型实验室 |
| Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ | ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ５ | 模块化设计，支持高通量（３８４孔板） |
| Ｒｏｃｈｅ | ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ４８０ | 超快升降温（１９°Ｃ／秒），精准温控 |
| Ｑｉａｇｅｎ | Ｒｏｔｏｒ－Ｇｅｎｅ Ｑ | 离心式温控，均一性好，适合低浓度样本 |
８． 未来发展趋势
数字化ＰＣＲ（ｄＰＣＲ）：通过微滴分区实现**定量，无需标准曲线。
便携化设备：手持式ｑＰＣＲ仪（如ＢｉｏＦｉｒｅ ＦｉｌｍＡｒｒａｙ）用于床边检测。
ＡＩ整合：自动优化引物设计、智能分析扩增异常曲线。
多重检测升级：支持１０＋靶标同步检测（如病原体ｐａｎｅｌ筛查）。
９． 常见问题（ＦＡＱ）
Ｑ：是否**须做标准曲线？
Ａ：**定量需要标准品绘制曲线；相对定量（如２＾－ΔΔＣｔ法）可不依赖标准曲线。Ｑ：熔解曲线出现多峰怎么办？
Ａ：可能为引物二聚体或非特异扩增，需优化引物浓度或退火温度。Ｑ：如何提高低浓度样本的检测灵敏度？
Ａ：增加模板体积、使用高灵敏度探针（如ＴａｑＭａｎ ＭＧＢ）、减少抑制剂干扰。
总结
实时荧光定量ＰＣＲ仪凭借高灵敏度、快速定量、闭管防污染等优势，已成为分子诊断和基因研究的核心技术平台。随着数字化、微流控等技术的融合，其在精准医学和即时检测（ＰＯＣＴ）中的应用将更加广泛。
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