定义
实时荧光ＰＣＲ分析仪是一种将传统ＰＣＲ扩增与荧光信号检测同步进行的高精度分子生物学设备。通过在ＰＣＲ反应体系中加入荧光标记物（探针或染料），实时监测扩增过程中荧光强度的变化，实现对目标核酸（ＤＮＡ／ＲＮＡ）的定量（**／相对）或定性分析，无需后期电泳检测。
核心原理
ＰＣＲ扩增基础
遵循聚合酶链式反应（ＰＣＲ）三步骤：变性（高温解链ＤＮＡ）、退火（引物结合模板）、延伸（合成新链）。
荧光信号生成
ＴａｑＭａｎ探针：５＇端报告基团（ＦＡＭ），３＇端淬灭基团（ＴＡＭＲＡ），水解后释放荧光。
分子信标：茎环结构，结合靶序列后发夹打开，荧光恢复。
双杂交探针：相邻探针发生ＦＲＥＴ能量转移产生荧光。
ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ等染料嵌入双链ＤＮＡ，发射荧光（强度与产物量成正比）。
缺点：易受非特异产物干扰。
荧光染料法（非特异性）：
荧光探针法（特异性）：
实时监测
每轮循环结束时检测荧光强度，生成扩增曲线。
阈值线（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）：背景荧光以上的设定值，与Ｃｔ值相关。
Ｃｔ值（Ｃｙｃｌｅ Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）：荧光强度达到阈值时的循环数，与起始模板量负相关（定量依据）。
核心组件
| 组件 | 功能 |
|---|---|
| 热循环模块 | 精确控制温度（±０．１℃），实现变性、退火、延伸的快速切换。 |
| 光学检测系统 | － 光源：ＬＥＤ、卤钨灯或激光器 － 滤光片／光栅：选择激发／发射波长 － 检测器：ＣＣＤ或ＰＭＴ捕获荧光信号 |
| 多通道检测 | 支持４－６色荧光通道（如ＦＡＭ， ＨＥＸ， ＲＯＸ， Ｃｙ５），实现多重检测。 |
| 温控技术 | － Ｐｅｌｔｉｅｒ半导体温控：主流技术 － 离心式空气加热（快速ＰＣＲ仪） |
| 软件与分析模块 | 控制仪器运行，分析扩增曲线、计算Ｃｔ值、生成标准曲线、输出定量／熔解曲线结果。 |
工作流程
样本准备：提取核酸（ＤＮＡ／ＲＮＡ），构建反应体系（引物、探针、酶、ｄＮＴＰｓ）。
加样：转移**专用ＰＣＲ管或９６／３８４孔板。
程序设置：
温度程序（预变性→循环扩增→延伸）
荧光通道选择（根据染料／探针波长）
实时监测：每轮循环结束采集荧光信号。
数据分析：
定量分析：通过标准曲线计算模板拷贝数（**定量）或相对表达量（如２＜ｓｕｐ＞−ΔΔＣｔ＜／ｓｕｐ＞法）。
定性分析：熔解曲线分析（ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ法验证产物特异性）。
阳性判定：Ｃｔ值≤预设阈值（通常３５－４０）。
关键性能参数
| 参数 | 意义 |
|---|---|
| 检测灵敏度 | **低可检出模板量（可达单拷贝级别）。 |
| 动态范围 | 可准确定量的浓度范围（通常跨越６－８个数量级）。 |
| 分辨率 | 区分浓度差异的能力（如±１．５倍差异）。 |
| 通量 | 单次运行样本数（９６孔／３８４孔板，高通量机型支持数千样本／天）。 |
| 升温／降温速率 | 影响ＰＣＲ速度（常规仪器：３－５°Ｃ／秒；快速ＰＣＲ仪：＞１０°Ｃ／秒）。 |
| 多色检测能力 | 支持同步检测的荧光通道数（４－６通道为主）。 |
主要应用领域
病原体检测
病毒（ＣＯＶＩＤ－１９、流感、ＨＩＶ）、**（结核分枝杆菌）、寄生虫的快速诊断。
基因表达分析
ｍＲＮＡ定量（ｑＲＴ－ＰＣＲ），研究基因调控机制。
基因分型与突变检测
ＳＮＰ分析、插入／缺失鉴定（探针法或熔解曲线分析）。
转基因检测
食品／作物中转基因成分定量（如３５Ｓ启动子、ＮＯＳ终止子）。
**开发与药效评估
靶基因表达水平监测。
法医学
ＤＮＡ指纹图谱、亲子鉴定。
优势与局限性
| 优势 | 局限性 |
|---|---|
| ▶ 高灵敏度与特异性 | ▶ 易受抑制剂影响（血色素、肝素等） |
| ▶ 闭管操作，降低污染风险 | ▶ 引物／探针设计难度高（尤其多重检测） |
| ▶ 定量范围广，无需后期处理 | ▶ 设备及试剂成本较高 |
| ▶ 快速获得结果（１－２小时） | ▶ 对实验操作规范性要求严格 |
| ▶ 支持多重检测（多靶标同步分析） | ▶ **定量需标准品（增加复杂性） |
使用注意事项
防污染措施：
分区域操作（试剂准备区→样本处理区→扩增区）。
使用带滤芯吸头、ＵＶ灯**工作台。
质量控制：
设置阴性对照（无模板）、阳性对照、内参基因（如ＧＡＰＤＨ）。
探针／染料选择：
多重检测需避免光谱重叠。
ＲＮＡ检测：
需逆转录步骤（ｑＲＴ－ＰＣＲ），严防ＲＮＡ酶污染。
发展趋势
便携化与现场检测
手持式／床旁快速ＰＣＲ仪（如用于突发疫情现场筛查）。
自动化整合
与核酸提取仪、液体处理工作站联用，构建全自动检测线。
数字ＰＣＲ（ｄＰＣＲ）互补
提供**定量无需标准曲线，适用于低丰度靶标分析。
多重检测能力提升
发展１０色以上荧光系统，实现超多重靶标同步检测。
ＡＩ辅助分析
自动识别异常扩增曲线，优化结果判读准确性。
代表厂商与机型
赛默飞世尔（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）：ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ５／７， ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ
伯乐（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）：ＣＦＸ９６／３８４， ＣＦＸ Ｏｐｕｓ
罗氏（Ｒｏｃｈｅ）：ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ４８０／９６
安捷伦（Ａｇｉｌｅｎｔ）：ＡｒｉａＭｘ
国产平台：宏石（ＳＬＡＮ）、博日（ＬｉｎｅＧｅｎｅ）
注：文章来源于网络，如有侵权，请联系删除
本信息来源于网络，仅供参考，不作为医用临床使用和诊断依据；
涉及产品（ 实时荧光PCR分析仪）可能含有禁忌内容或者注意事项，具体详见说明书；
消费者应仔细阅读产品说明书或者在医务人员的指导下购买和使用。
涉及产品名称、品牌、型号、中标参考价企业名称等信息均来自网络或AI生成，不作为下单采购依据，如有侵权请联系删除屏蔽处理。